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10 mM Ammoniumacetat in Wasser bestanden Bei der hier verwendeten neueren Methode wurden die Lösungsmittel durch Mischungen aus Acetonitril und Wasser mit einem Gehalt von 5 mM Ammoniumacetat ersetzt Infolgedessen sollte die notwendige Wasserschicht auf der HILIC-Trennsäule nicht durch wechselnde Salzgehalte während der Gradienten der mobilen Phase beeinflusst werden was vermutlich die Robustheit der HILIC weiter erhöht Während der Trennmechanismus bei der RPLC mit unpolaren endgekappten stationären Phasen nahezu unabhängig vom Salzgehalt ist reagiert die HILIC sehr empfindlich auf Salzänderungen b Rekonditionierungsbedingungen Das Gleichgewicht hängt nicht von der Re-Äquilibrierungszeit ab sondern vom Lösungsmittelvolumen das durch die Säule fließt Bei der RPLC werden etwa zehn Säulenvolumina benötigt während bei der HILIC in der Regel bis zu 20 – 30 Säulenvolumina für eine vollständige Re-Äquilibrierung erforderlich sind Bei einer Dimension von 100 x 2 1 mm für die HILIC-Säule betrug das Säulenvolumen etwa 250 µl Mit den vordefinierten mobilen Flussraten von 0 035 ml min von Pumpe 1 und 0 6 ml min von Pumpe 2 sollte die Re-Äquilibrierung innerhalb von acht bis zwölf Minuten ausreichend sein Der Re-Äquilibrierungszustand wurde mit mehreren Injektionen nach definierten Re-Äquilibrierungszeiten getestet Schließlich zeigte eine Re-Äquilibrierungsphase von elf Minuten geeignete Ergebnisse bei der Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten Bild 4 c Gesamtlaufzeit Die ursprüngliche Methode dauerte fast 60 Minuten Da die Flüssigkeitschromatographie unter Ultrahochdruckbedingungen sehr stabil ist z Bbei der Verwendung von UHPLC-Pumpen und Sub-2-µm-Teilchen sowie Core-Shell-Partikeln und da Massenspektrometer auch mit höheren Detektionsraten arbeiten konnte die Laufzeit deutlich reduziert werden Dies war auf zwei unabhängige Faktoren zurückzuführen auf die Trenngeschwindigkeit und auf die angepasste Re-Äquilibrierungsphase Infolgedessen konnte die endgültige Methode auf eine Gesamtlaufzeit von 35 Minuten verkürzt werden Dies ist eine erhebliche Verbesserung gegenüber der ursprünglichen Methode so dass diese Methode in der Routine analyse mit höherem Durchsatz eingesetzt werden kann Fazit Mit dem hier vorgestellten RPLC-HILIC-Setup können komplexe Proben innerhalb von 35 Minuten auf sehr polare bis unpolare Verbindungen gescreent werden In Verbindung mit dem hier eingesetzten Massenspektrometer zur Detektion können Proben im Hochdurchsatz gescreent werden Da hiermit im positiven und negativen Ionisierungsmodus parallel analysiert werden kann kann die Analysezeit weiter signifikant reduziert werden Von ursprünglich acht Stunden ein Spüllauf drei Wiederholungsanalysen der Probe im positiven Ionisierungsmodus ein Spüllauf drei Wiederholungsanalysen der Probe im negativen Ionisierungsmodus jeweils 60 Minuten lang konnte die Zeit für die Analyse einer Probe auf etwa 2 5 Stunden reduziert werden ein Spüllauf drei Wiederholungsanalysen der Probe im parallelen positiven und negativen Ionisierungsmodus jeweils 35 Minuten Das ist weniger als 1 3 der ursprünglichen Analysedauer Ein Jahrzehnt nach der Einführung der RPLC-HILIC-MS MS -Methode für analytische Zielsetzungen – auch für das Non-Target-Screening – findet die Technik von reinen Entdeckungsanwendungen breitere Anwendung in Forschungsoder auch Auftragslaboren Der hier verwendete „polaritätserweiterte“ chromatographische Trennaufbau mit der seriellen RPLC-HILIC-Kopplung durch einfache Kombination mit Gradientenpumpen über T-Stücke kann für zahlreiche Anwendungen von Nutzen sein Der Einsatz der seriellen Kopplung erweitert den analytisch zugänglichen Raum und kann ganz neue Einblicke ermöglichen Bild 5 zeigt beispielhaft Daten einer mittels RPLC-HILIC ESI-MS MS analysierten Wasserprobe einer Partnereinrichtung ESI electrospray ionization Darin lassen sich mehr als 900 Massensignale nachweisen Diese verteilen sich hier in ähnlichen Anteilen auf die HILICund die RPLC-Trennung 512 zu 404 Signale Die „polaritätserweiterte“ Chromatographie kann in der Umweltanalytik aber auch der Lebensmittelanalytik in Metabolomics dem chemischen und pharmakologischen Prozessmonitoring sowie Non-Target-Analytik in anderen Bereichen eingesetzt werden Umweltanalytik | Chromatographie www labo de Lovibond ® Water Testing XD7500 XD7000 Herausragendes Preis-Leistungsverhältnis Hochwertige Referenzstrahl Optik Automatische Testerkennung über Barcodesystem Automatische Küvettenerkennung Mehr als 150 analytische Methoden vorprogrammiert Brilliantes Farbdisplay Schnittstellen Ethernet USB UV-VIS Spektralphotometer zur Wasseranalyse In 10 Sprachen erhältlich Optimieren Sie Ihre Arbeit Sparen Sie Zeit Geld QUALITY Made in GERMANY verkauf@lovibond com www lovibond com