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senpumpen Sub-2-µm-Partikel usw wurde der ursprüngliche Instrumentenaufbau vollständig überarbeitet Dabei sollten allerdings die Stabilität der Probeninjektion insbesondere für die HILIC-Trennleistung die Robustheit der Retentionszeiten < 2 % und andere Qualitätskriterien gleichbleiben wie mit dem ursprünglichen Aufbau [4] Andererseits sollte der Zeitbedarf für die Trennung deutlich verkürzt werden der früher verwendete Salzgradient in der mobilen Phase bei HILIC vermieden werden und der Ausgangsgehalt an Wasser bei 5 % liegen Nicht zuletzt aufgrund neuer massenspektrometrischer Ionenquellenkonzepte wurde der bisher häufig eingesetzte „Makeup-Flow“ überflüssig und es konnte eine „positiv negativ-Switching“-Ionisation in der HRMS eingesetzt werden Die Anordnung der instrumentellen Komponenten Bild 1 bleibt jedoch gleich wie in der ursprünglich beschriebenen Methode Instrumentelles Der chromatographische Aufbau bestand aus einem „Vanquish Flex LC“-System von Thermo Fisher Scientific mit zwei binären Pumpen einem Autosampler und einem Säulenofen der eine HILICund eine RPLC-Säule enthielt die über ein T-Stück in Reihe geschaltet waren Die RP-Trennung wurde auf einer „Thermo Fisher Accucore“-C18-Säule 50 x 2 1 mm 2 6 µm P N 17126-052130 durchgeführt Die mobile Phase der RPLC-Trennpumpe bestand aus A H 2 O ACN 95 5 v v mit 5 mM NH 4 Ac Ammoniumacetat und B ACN H 2 O 95 5 v v mit 5 mM NH 4 Ac Die HILIC-Trennung wurde auf einer „ThermoFisher Synchronis“ HILIC-Säule 100 x 2 1 mm 1 7 µm P N 97502-102130 durchgeführt Die mobile Phase der HILIC-Trennpumpen bestand für Lösung Aaus ACN Acetonitril und für Lösung Baus H 2 O ACN 95 5 v v Informationen zu den Gradienten sind in Bild 2 linke Seite zu finden Das Injektionsvolumen betrug 10 µl Das chromatographische System war an ein Orbitrap-Massenspektrometer „Exploris 120“ Thermo Fisher Scientific angeschlossen das mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle Modell H-ESI ausgestattet war Durch die Verwendung kleinerer Partikel in den stationären Phasen in Kombination mit Ultrahochdruck-Flüssigphasenpumpen UHPLC konnte die Trennung von 58 Minuten auf ca 35 Minuten beschleunigt werden Dies ist auf die höheren Durchflussraten a der HILIC-Säule 1 7 µm Partikelgröße Durchflussrate von 600 µl min und b der RPLC-Säule 2 6 µm Partikelgröße maximalen Durchflussrate von 200 µl min zurückzuführen s hierzu Bild 2 Das führt letztlich zu schnelleren Gradienten der mobilen Phase und auch zu einer beschleunigten Re-Äquilibrierung In Bild 3 sind die Referenzsubstanzen schematisch dargestellt die mit dem Flussgradienten in der HILIC-Säule s links blauer Kasten und dem nachfolgenden Flussgradienten in der RPLC-Säule s rechts roter Kasten getrennt wurden Details zu den verwendeten Materialien Methoden und Chemikalien finden sich in der ausführlichen „Technical note“ hierzu [5] Im Folgenden werden einige Schlüsselaspekte bei der Entwicklung des neuen Aufbaus vorgestellt Vorgehensweise zur Methodenoptimierung Zu Beginn der Methodenoptimierung wurden die RPLCund HILIC-Trennungen getrennt bewertet um die Beiträge der einzelnen Säulen zu den Gesamttrennungen zu beurteilen Daher wurden nur Umweltanalytik | Chromatographie 13 www labo de 12 2023 Bild 2 Systembedingungen der UHPLC-Kopplung Bild AFIN-TS