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Eine andere gängige Derivatisierungsmethode verwendet das Reagenz o-Phthaldialdehyd OPA das nach oder vor der analytischen Trennung mit den Aminosäuren reagiert [4] Sekundäre Aminosäuren wie Prolin werden häufig mit 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid FMOC derivatisiert da sie nicht mit OPA reagieren [5] Obwohl die Nachsäulenderivatisierung für die Aminosäureanalyse mit HPLC eine gängige Methode z Bin sogenannten Aminosäureanalysatoren ist bringt sie auch Nachteile mit sich Dazu zählen die lange Analysezeit aufgrund der Eigenschaften der Säule eine recht komplexe Instrumentenkonfiguration sowie ein recht hoher Verbrauch an Fließmitteln und Derivatisierungsreagenzien Auch über eine Vorsäulenderivatisierung kann eine schnelle und einfache Analyse von Aminosäuren möglich sein jedoch können Derivatisierungsvorgang und der Einfluss der Matrix Probleme verursachen Durch neuere Entwicklungen in der Autosampler-Technik können diese Derivatisierungsschritte mit Hilfe automatisierter Funktionen zur Probenvorbehandlung direkt im Autosampler erfolgen und damit den Arbeitsaufwand minimieren Dabei werden die Proben direkt vor der HPLC-Trennung entweder in einem separaten Reaktionsgefäß oder in der Injektionsnadel des Autosamplers derivatisiert Vorsäulenderivatisierung Bei der Vorsäulenderivatisierung erfolgt die chemische Modifikation der Aminosäuren vor der chromatographischen Trennung Die Derivatisierung ist für die Detektion der Aminosäuren mit dem Fluoreszenz-Detektor erforderlich Bild 1 zeigt Möglichkeiten Aminosäuren mit einem geeigneten Derivatisierungsmittel umzusetzen um ein stabiles über die Fluoreszenz detektierbares Derivat zu erhalten Dies kann unter verschiedenen Bedingungen ablaufen wie beispielsweise bei erhöhter Temperatur oder in Gegenwart eines Katalysators Die Wahl des Derivatisierungsmittels hängt von verschiedenen Faktoren ab wie z Bder Art der Aminosäure und der Detektionsmethode So eignet sich wie oben genannt OPA besonders für primäre Aminosäuren während FMOC-Chlorid vor allem für sekundäre Aminosäuren wie Prolin verwendet wird Die Reaktionsbedingungen wie z BpH-Wert Temperatur und Reaktionszeit sind entscheidend für eine effiziente Derivatisierung Eine sorgfältige Optimierung dieser Bedingungen ist erforderlich um eine vollständige und reproduzierbare Derivatisierung der Aminosäuren zu gewährleisten Derivatisierung in der Autosampler-Nadel Es ist auch möglich die Derivatisierung in der Nadel des Autosamplers durchzuführen So kann eine Derivatisierung mit einer einfachen Systemkonfiguration automatisiert erfolgen Eine neu entwickelte Methode zur Probenvorbereitung ermöglicht die direkte Aminosäurederivatisierung in der Autosampler-Nadel selbst bei sehr geringen Probenvolumina von 1 µl [6] Dies ermöglicht eine effiziente Nutzung der Proben und eine verbesserte Produktivität in der Analytik Hierfür wurde das HPLC-System Nexera LC-40XR LPGE der Autosampler SIL-40XR und der Fluoreszenzdetektor RF-20Axs alle von Shimadzu verwendet Die frei programmierbare integrierte Funktion zur Probenvorbehandlung „Pretreatment“-Funktion des Autosamplers ermöglicht eine automatisierte Durchführung verschiedener Vorbehandlungsschritte Der Autosampler pipettiert die Probe und die erforderlichen Reagenzien zunächst in der Injektionsnadel mischt sie dort und injiziert an-Lebensmittelanalytik 19 www labo de 7-8 2023 Bild 2 Fließdiagramm zur automatisierten Vorsäulenderivatisierung in der Autosampler-Nadel links sowie die Methodenparameter rechts Bild Shimadzu
