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Die Forschungsgruppe von Prof Dr Markus Sauer Rudolf-Virchow-Zentrum und Biozentrum und Dr Gerti Beliu Rudolf-Virchow-Zentrum der Universität Würzburg hat eine „Photoswitching Fingerabdruck“-Methode entwickelt mit der dynamische Wechselwirkungen mit anderen Molekülen in der Zelle optisch dargestellt werden können Einzelmolekül-Lokalisations-Mikroskopiemethoden wie „dSTORM“ die in der Arbeitsgruppe von Prof Dr Markus Sauer entwickelt wurden ermöglichen Auflösungen im Bereich von 10 – 20 nm In Kombination mit strukturierten Beleuchtungsverfahren konnten Lokalisationsgenauigkeiten von bis zu 1 nm für Farbstoffe erreicht werden Doch diese hohe Lokalisationspräzision konnte nicht in eine räumliche Auflösung von wenigen Nanometern in Zellen übersetzt werden Denn gängige Markierungsmethoden verursachen Abstandsfehler von mehr als 10 nm Die Größe der Markierungsmoleküle verhindert eine Auflösung im Nanometerbereich Die Ursache für die Sub-10-nm-Auflösungsbarriere war bisher nicht bekannt „In unserer Publi kation konnten wir nun erstmals zeigen dass die Photoschaltraten Blinking der Farbstoffe zwischen einem Anund Aus-Zustand bei Abständen unterhalb von 10 nm aufgrund verschiedener Energietransferprozesse zwischen Farbstoffen stark beeinflusst wird Hierdurch kommt es während den ersten Sekunden eines Experiments gehäuft zu An-Zuständen und damit verbunden zum schnellen Photobleichen der Farbstoffe was ihre individuelle Lokalisation erschwert“ erklärt Sauer „Die verringerte Lokalisationswahrscheinlichkeit der Farbstoffe resultiert daher in einer schlechteren strukturellen Auflösung als man aufgrund der individuellen Lokalisationsgenauigkeit erwarten würde Dies ähnelt einem Orchester indem alle Instrumente zeitgleich am Anfang des Stücks ihre Beiträge spielen es ist unmöglich die einzelnen Tonspuren herauszuhören “ Zeitaufgelöste Fluoreszenzdetektion Der Photoswitching-Fingerabdruck Photoswitching Fingerprint und die Fluoreszenzabklingdauer enthalten aber auch Information über die Anzahl der vorhandenen Farbstoffe und – aufgrund der Abstandabhängigkeit der Energietransferprozesse – auch Information über deren Abstände ohne dass man die einzelnen Farbstoffe optisch auflösen kann Durch den Einbau unnatürlicher Aminosäuren in multimere Membranrezeptoren der Erweiterung des genetischen Codes Genetic Code Expansion mit anschließender bioorthogonaler Click-Markierung mit kleinen Fluoreszenz-Farbstoffen konnten die Würzburger Forschungsgruppen nun im nächsten Schritt aufzeigen wie die spezifische ortsgenaue Markierung von Proteinen in Zellen ohne Abstandsfehler mit Sub-10-nm-Abständen gelingen kann „Durch die Analyse der Photoswitching Fingerprints der multimeren Rezeptoren in der Plasmamembran konnten wir so erstmals Abstände zwischen Rezeptoruntereinheiten im Bereich von 5 – 7 nm in Zellen abschätzen und die Anzahl der markierten Untereinheiten bestimmen“ sagt Beliu Förderung Die Studie wurde aus Mitteln des European Research Council ERC under the European Union’s Horizon 2020 research and innovation programme grant agreement No 835102 und von der Deutschen Forschungsgemeinschaft DFG SA829 19-1 gefördert Publikation Photoswitching fingerprint analysis bypasses the 10 nm resolution barrier Dominic Helmerich Gerti Beliu Danush Taban Mara Meub Marcel Streit Alexander Kuhlemann Sören Doose and Markus Sauer Nature Methods August 2022 doi org 10 1038 s41592-022-01548-6 Quelle Universität Würzburg Dynamische Molekülwechselwirkungen optisch darstellen Fluoreszenzmikroskopie Mikroskopie 41 www labo de 9 2022