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von 1 x 10 14 m l eine erhebliche Aggregation auf Eine Verdünnungsstudie ergab dass diese Aggregate reversibel waren und bei niedrigeren Konzentrationen verschwanden In einer zweiten Studie Mitte wurden verschiedene Pufferadditive untersucht um festzustellen welche für die Auslösung der Aggregation verantwortlich sind Zuletzt wurde die Probe auf ihre Temperaturstabilität hin untersucht In diesem Fall zeigte sich bei allen Proben der Beginn der Aggregatbildung bei etwa derselben Temperatur unabhängig von der Konzentration oder den Pufferkomponenten SEC-MALS Die kombinierte Technik SEC-MALS eignet sich zur Charakterisierung kleiner Viren sowie von Proteinen Polymeren und Polypeptiden In Verbindung mit UVund Brechungsindex RI -Detektion zur Charakterisierung von Proteinen kann SEC-MALS Informationen über Konjugation oligomeren Zustand Molekulargewicht Aggregation Struktur reversible Assoziation und den UV-Extinktionskoeffizient liefern Durch die Kombination von Lichtstreuung und Konzentrationsbestimmung aus zwei Signalquellen können AAV-Partikelkonzentration Kapsidgehalt und Aggregationsgrad ohne vorherige Kalibrierung bestimmt werden AAVs sind im Wesentlichen Konjugate aus DNA und Protein und können daher in einer SEC-MALS-UV-RI-Konjugatanalyse untersucht werden Die Konjugatanalyse zeigt das Molekulargewicht und die Massenkonzentration sowohl der Proteinkapside als auch der DNA getrennt auf woraus sich das Verhältnis von leeren zu vollen Kapsiden ergibt Bild 2 zeigt Messungen von mehreren Proben mit unterschiedlichen Verhältnissen von leeren zu vollen Kapsiden Die einzige Annahme bei der Analyse der Partikelkonzentration ist dass eine 100-prozentige Rückgewinnung von der SEC-Säule erfolgt Es hat sich gezeigt dass diese Annahme bei der hier verwendeten SEC-Methode im Allgemeinen gültig ist Da die Reihenfolge der SEC-Elution auf der Größe basiert ist es auch möglich den Aggregationsgrad der Probe zu bewerten und zu quantifizieren Die SEC-MALS-Analyse kann jedoch nicht zwischen Kapsiden mit einem partiellen Genom und einer Mischung leerer und voller Kapsiden unterscheiden Das Vorhandensein von partiellen AAVs beeinträchtigt jedoch nur die Genauigkeit nicht aber die Präzision der Messung des Kapsidgehalts Auch die Bestimmung der Gesamtkonzentration der AAV-Partikel wird durch das Vorhandensein partieller AAVs nicht beeinträchtigt Die SEC-MALS-Methode bietet viele Vorteile bei der Messung der AAV-CQAs in einem einzigen Lauf Sie erfordert eine minimale Probenmenge mit einer Konzentration in der Größenordnung von mindestens 10 11 Partikel ml Darüber hinaus sind die in der Methode enthaltenen Probenparameter auf fast alle Serotypen anwendbar FFF-MALS und FFF-DLS Ab einer bestimmten Partikelgröße stoßen SEC-Säulen an ihre Grenzen Hier kann die Feldflussfraktionierung FFF für die Trennung von Nanopartikeln einschließlich größerer Viren wie Adenoviren und Lentiviren sowie großer AAV-Aggregate zum Einsatz kommen In Kombination mit MALS kann mit FFF die Größenverteilung mit hoher Auflösung bestimmt werden und eine ähnliche Charakterisierung wie mit SEC-MALS erhalten werden Wie bei der SEC wird die Trennung bei der FFF durch das hydrodynamische Volumen bestimmt 24 www labo de 11 2021 Chromatographie und Spektroskopie Bild 4 Untersuchung von LNPs mit Hilfe von verschiedenen Analysemethoden basierend auf dem Prinzip der Lichtstreuung Mittels DLS können zunächst nur subtile Unterschiede in den Proben identifiziert werden links Durch FFF-MALS wird die Probe vor der Analyse nach hydrodynamischer Größe aufgetrennt wodurch eine detailliertere Analyse erzielt wird Mitte Des Weiteren kann durch FFF-MALS auch die Menge an im LNP enthaltene mRNA bestimmt werden rechts Bild Wyatt Technology Corporation