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durch die PCR-Analytik erfüllt die weltweit von Betriebslaboren zur Eigenüberwachung genutzt wird Auch Dienstleistungslabore bieten diese schnelle Methode an Anwender können Gefährdungssituationen so unmittelbar erkennen und frühzeitig Gegenmaßnahmen ergreifen Möglichkeiten des PCR-Legionellennachweises Durch regelmäßiges Ermitteln der LegionellenKonzentration in einer Anlage kann das Risiko einer Freisetzung von Legionellen eingeschätzt werden Idealerweise wird hier aufgeschlüsselt nach Legionella spp sowie den klinisch relevanten Spezies Legionella pneumophila und Lpn Serogruppe 1 Das Ergebnis sollte Zellen in Amöben und Biofilmen mit einschließen und die ermittelte Konzentration muss sich auf lebende Legionellen beziehen Auch muss das Verfahren robust sein also auch für schwierigere Matrices einsetzbar sein All das ist mit dem System microproof® Legionella Quantification LyoKit in Kombination mit dem Aufbereitungsprotokoll des foodproof® StarPrep Two Kit von Biotecon Diagnostics möglich In weniger als vier Stunden liegt dem Anlagenbetreiber ein eindeutiges und umfassendes Ergebnis der Legionellen-Zellzahl vor inklusive Unterscheidung der gefährlichsten Spezies Das Gesamtverfahren wurde nach ISO TS 12869 2019 validiert Diese Norm gibt strenge Qualitätskriterien für den PCR-Nachweis von Legionellen vor und beschreibt auch den Ablauf einer Verifizierung für Prüflabore welche die Akkreditierung des Verfahrens anstreben Hervorzuheben ist dass die Validierung auf einer Vielzahl von marktüblichen Real-Time-PCR-Geräten erfolgte und auch Abwasser und Kühlturmproben mit einbezog Möglichkeiten der PCR Kerntechnologie dieses Real-Time-PCR-Testes ist der Nachweis spezifischer DNA-Moleküle der Legionellen Das Endergebnis liegt normgemäß in Genkopien pro Probevolumen vor Da hier bei der Probenbearbeitung eine Lebend-Differenzierung mittels der Komponente Reagent Derfolgt entspricht dies der tatsächlichen Legionella-Lebendzellzahl Nachteile typischer PCR-Verfahren welche auch die DNA toter Zellen nachweisen werden so umgangen DNA als Grundlage einer Nachweismethode zu verwenden ist in vielerlei Hinsicht vorteilhaft Es wird keine Anzucht von Legionellen benötigt und der Test ist hochspezifisch nur die Zielorganismen werden detektiert Nicht-Legionellen die üblicherweise auf Agar für falschpositive Ergebnisse sorgen werden durch die PCR sicher ausgeschlossen Aus diesem Grund spielt es auch keine Rolle welche Arten von Begleitflora sich in der Probe befinden und wie hoch diese konzentriert sind Säureoder Hitzebehandlung die zur Unterdrückung der Begleitflora in der Kulturmethode angewendet werden müssen entfallen daher bei der PCR Die einfachen Bearbeitungsprotokolle sind universell auf alle Wasserarten anwendbar aufwändige Reinigungsverfahren für schmutzige Wässer sind nicht nötig Zudem ermöglicht die PCR Multiplexing also den gleichzeitigen Nachweis verschiedener Legionella-Arten in einer einzigen Analyse Die Interpretation der Daten erfolgt automatisiert über ein Softwaretool Ein solcher Test ist daher für den Anwender auch ohne PCRErfahrung leicht durchzuführen Die Nachweisgrenzen des microproof Legionella Quantification LyoKit sind mit denen des kulturellen Verfahrens nach ISO 11731 vergleichbar Kulturversus PCR-Verfahren Basierend auf der Kulturmethode wurden Grenzwerte festgelegt die in koloniebildenden Einheiten pro Volumen festgeschrieben sind Noch existieren keine entsprechenden Werte für die Legionellen-PCR und das Ergebnis wird in Genkopien pro Volumen angegeben dies entspricht der tatsächlichen Zellzahl Würde für die Kulturmethode gelten dass stets eine Legionella-Zelle in der Ausgangsprobe zu exakt einer Kolonie auf der Platte heranwächst dann korrelierten die Ergebnisse der ISO 11731 und PCR sehr gut Durch die oft ungenügende Genauigkeit der Kulturmethode gelingt eine derartige Umrechnung aber nicht ohne weiteres Insbesondere bei komplexen Proben mit Biofilmanteilen oder Amöben liegen die ermittelten Koloniezahlen teils deutlich unter der tatsächlichen Zellzahl Studien in denen Kultur und PCR verglichen wurden zeigen dass ein negatives PCR-Ergebnis mit 100%iger Sicherheit auch ein negatives Ergebnis der kulturellen Untersuchung nach sich zieht und dass die PCR sensitiver ist Collins 2017 Die ermittelten Genkopien liegen in der Regel über den ermittelten Koloniezahlen derselben Probe Das bietet einen Orientierungspunkt bei der Interpretation der Ergebnisse Spätestens bei einem Ausbruchsgeschehen ist es unersetzlich eine große Menge Proben mittels PCR schnell auf das Vorhandensein aller relevanten Legionellen zu prüfen Diese Untersuchungen mündeten in einer Neufassung der Norm VDI 4259 welche Maßnahmen bei Legionellose-Ausbrüchen festlegt und explizit PCR als Analysemethode nennt In der Routine eingesetzt erfährt der Betreiber durch ein PCR-Screening welche Teile des Systems Legionellenbelastet sind und kann Maßnahmen durchführen bevor eine Überschreitung kultureller Grenzwerte ein langes und kostspieliges Abschalten des Wasseroder Kühlsystems erfordert Wasseranalytik | Schwerpunkt www labo de 3 2021 23